Chapter-11 Biotechnology Principles and Processes
Biotechnology deals with techniques of using live organisms or enzymes from organisms to produce products and processes useful to humans. In this sense, making curd, bread or wine, which are all microbe-mediated processes, could also be thought as a form of biotechnology. However, it is used in a restricted sense today, to refer to such of those processes which use genetically modified organisms to achieve the same on a larger scale. Further, many other processes/techniques are also included under biotechnology. For example, in vitro fertilisation leading to a ‘test-tube’ baby, synthesising a gene and using it, developing a DNA vaccine or correcting a defective gene, are all part of biotechnology.
The European Federation of Biotechnology (EFB) has given a definition of biotechnology that encompasses both traditional view and modern molecular biotechnology. The definition given by EFB is as follows: ‘The integration of natural science and organisms, cells, parts thereof, and molecular analogues for products and services’.
11.1 PRINCIPLES OF BIOTECHNOLOGY
Among many, the two core techniques that enabled birth of modern biotechnology are :
(i) Genetic engineering : Techniques to alter the chemistry of genetic material (DNA and RNA), to introduce these into host organisms and thus change the phenotype of the host organism.
(ii) Bioprocess engineering : Maintenance of sterile (microbial contamination-free) ambience in chemical engineering processes to enable growth of only the desired microbe/eukaryotic cell in large quantities for the manufacture of biotechnological products like antibiotics, vaccines, enzymes, etc.
Let us now understand the conceptual development of the principles of genetic engineering. You probably appreciate the advantages of sexual reproduction over asexual reproduction. The former provides opportunities for variations and formulation of unique combinations of genetic setup, some of which may be beneficial to the organism as well as the population. Asexual reproduction preserves the genetic information, while sexual reproduction permits variation. Traditional hybridisation procedures used in plant and animal breeding, very often lead to inclusion and multiplication of undesirable genes along with the desired genes. The techniques of genetic engineering which include creation of recombinant DNA, use of gene cloning and gene transfer, overcome this limitation and allows us to isolate and introduce only one or a set of desirable genes without introducing undesirable genes into the target organism.
Do you know the likely fate of a piece of DNA, which is somehow transferred into an alien organism? Most likely, this piece of DNA would not be able to multiply itself in the progeny cells of the organism. But, when it gets integrated into the genome of the recipient, it may multiply and be inherited along with the host DNA. This is because the alien piece of DNA has become part of a chromosome, which has the ability to replicate. In a chromosome there is a specific DNA sequence called the origin of replication, which is responsible for initiating replication. Therefore, for the multiplication of any alien piece of DNA in an organism it needs to be a part of a chromosome(s) which has a specific sequence known as ‘origin of replication’. Thus, an alien DNA is linked with the origin of replication, so that, this alien piece of DNA can replicate and multiply itself in the host organism. This can also be called as cloning or making multiple identical copies of any template DNA.
Let us now focus on the first instance of the construction of an artificial recombinant DNA molecule. The construction of the first recombinant DNA emerged from the possibility of linking a gene encoding antibiotic resistance with a native plasmid (autonomously replicating circular extra-chromosomal DNA) of Salmonella typhimurium. Stanley Cohen and Herbert Boyer accomplished this in 1972 by isolating the antibiotic resistance gene by cutting out a piece of DNA from a plasmid which was responsible for conferring antibiotic resistance. The cutting of DNA at specific locations became possible with the discovery of the so-called ‘molecular scissors’– restriction enzymes. The cut piece of DNA was then linked with the plasmid DNA. These plasmid DNA act as vectors to transfer the piece of DNA attached to it. You probably know that mosquito acts as an insect vector to transfer the malarial parasite into human body. In the same way, a plasmid can be used as vector to deliver an alien piece of DNA into the host organism. The linking of antibiotic resistance gene with the plasmid vector became possible with the enzyme DNA ligase, which acts on cut DNA molecules and joins their ends. This makes a new combination of circular autonomously replicating DNA created in vitro and is known as recombinant DNA. When this DNA is transferred into Escherichia coli, a bacterium closely related to Salmonella, it could replicate using the new host’s DNA polymerase enzyme and make multiple copies. The ability to multiply copies of antibiotic resistance gene in E. coli was called cloning of antibiotic resistance gene in E. coli.
You can hence infer that there are three basic steps in genetically modifying an organism —
(i) identification of DNA with desirable genes;
(ii) introduction of the identified DNA into the host;
(iii) maintenance of introduced DNA in the host and transfer of the DNA to its progeny.
11.2 TOOLS OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY
Now we know from the foregoing discussion that genetic engineering or recombinant DNA technology can be accomplished only if we have the key tools, i.e., restriction enzymes, polymerase enzymes, ligases, vectors and the host organism. Let us try to understand some of these in detail.
11.2.1 Restriction Enzymes
In the year 1963, the two enzymes responsible for restricting the growth of bacteriophage in Escherichia coli were isolated. One of these added methyl groups to DNA, while the other cut DNA. The later was called restriction endonuclease.
The first restriction endonuclease–Hind II, whose functioning depended on a specific DNA nucleotide sequence was isolated and characterised five years later. It was found that Hind II always cut DNA molecules at a particular point by recognising a specific sequence of six base pairs. This specific base sequence is known as the recognition sequence for Hind II. Besides Hind II, today we know more than 900 restriction enzymes that have been isolated from over 230 strains of bacteria each of which recognise different recognition sequences.
The convention for naming these enzymes is the first letter of the name comes from the genus and the second two letters come from the species of the prokaryotic cell from which they were isolated, e.g., EcoRI comes from Escherichia coli RY 13. In EcoRI, the letter ‘R’ is derived from the name of strain. Roman numbers following the names indicate the order in which the enzymes were isolated from that strain of bacteria.
Restriction enzymes belong to a larger class of enzymes called nucleases. These are of two kinds; exonucleases and endonucleases. Exonucleases remove nucleotides from the ends of the DNA whereas, endonucleases make cuts at specific positions within the DNA.
Each restriction endonuclease functions by ‘inspecting’ the length of a DNA sequence. Once it finds its specific recognition sequence, it will bind to the DNA and cut each of the two strands of the double helix at specific points in their sugar -phosphate backbones (Figure 11.1). Each restriction endonuclease recognises a specific palindromic nucleotide sequences in the DNA.
Figure 11.1 Steps in formation of recombinant DNA by action of restriction endonuclease enzyme - EcoRI
Do you know what palindromes are? These are groups of letters that form the same words when read both forward and backward, e.g., “MALAYALAM”. As against a word-palindrome where the same word is read in both directions, the palindrome in DNA is a sequence of base pairs that reads same on the two strands when orientation of reading is kept the same. For example, the following sequences reads the same on the two strands in 5’ $\rightarrow$ 3’ direction. This is also true if read in the 3’ $\rightarrow$ 5’ direction
$ \begin{aligned} 5^{\prime}—– \text { GAATTC }—– 3^{\prime} \\ 3^{\prime}—–\text { CTTAAG }—–5^{\prime} \end{aligned} $
Restriction enzymes cut the strand of DNA a little away from the centre of the palindrome sites, but between the same two bases on the opposite strands. This leaves single stranded portions at the ends. There are overhanging stretches called sticky ends on each strand (Figure 11.1). These are named so because they form hydrogen bonds with their complementary cut counterparts. This stickiness of the ends facilitates the action of the enzyme DNA ligase.
Restriction endonucleases are used in genetic engineering to form ‘recombinant’ molecules of DNA, which are composed of DNA from different sources/genomes.
When cut by the same restriction enzyme, the resultant DNA fragments have the same kind of ‘sticky-ends’ and, these can be joined together (end-to-end) using DNA ligases (Figure 11.2).
Figure 11.2 Diagrammatic representation of recombinant DNA technology
You may have realised that normally, unless one cuts the vector and the source DNA with the same restriction enzyme, the recombinant vector molecule cannot be created.
Separation and isolation of DNA fragments : The cutting of DNA by restriction endonucleases results in the fragments of DNA. These fragments can be separated by a technique known as gel electrophoresis. Since DNA fragments are negatively charged molecules they can be separated by forcing them to move towards the anode under an electric field through a medium/matrix. Nowadays the most commonly used matrix is agarose which is a natural polymer extracted from sea weeds. The DNA fragments separate (resolve) according to their size through sieving effect provided by the agarose gel. Hence, the smaller the fragment size, the farther it moves. Look at the Figure 11.3 and guess at which end of the gel the sample was loaded.
Figure 11.3 A typical agarose gel electrophoresis showing migration of undigested (lane 1) and digested set of DNA fragments (lane 2 to 4)
The separated DNA fragments can be visualised only after staining the DNA with a compound known as ethidium bromide followed by exposure to UV radiation (you cannot see pure DNA fragments in the visible light and without staining). You can see bright orange coloured bands of DNA in a ethidium bromide stained gel exposed to UV light (Figure 11.3). The separated bands of DNA are cut out from the agarose gel and extracted from the gel piece. This step is known as elution. The DNA fragments purified in this way are used in constructing recombinant DNA by joining them with cloning vectors.
11.2.2 Cloning Vectors
You know that plasmids and bacteriophages have the ability to replicate within bacterial cells independent of the control of chromosomal DNA. Bacteriophages because of their high number per cell, have very high copy numbers of their genome within the bacterial cells. Some plasmids may have only one or two copies per cell whereas others may have 15-100 copies per cell. Their numbers can go even higher. If we are able to link an alien piece of DNA with bacteriophage or plasmid DNA, we can multiply its numbers equal to the copy number of the plasmid or bacteriophage. Vectors used at present, are engineered in such a way that they help easy linking of foreign DNA and selection of recombinants from non-recombinants.
The following are the features that are required to facilitate cloning into a vector.
(i) Origin of replication (ori) : This is a sequence from where replication starts and any piece of DNA when linked to this sequence can be made to replicate within the host cells. This sequence is also responsible for controlling the copy number of the linked DNA. So, if one wants to recover many copies of the target DNA it should be cloned in a vector whose origin support high copy number.
(ii) Selectable marker : In addition to ‘ori’, the vector requires a selectable marker, which helps in identifying and eliminating nontransformants and selectively ermitting the growth of the transformants. Transformation is a procedure through which a piece of DNA is introduced in a host bacterium (you will study the process in subsequent section). Normally, the genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, chloramphenicol, tetracycline or kanamycin, etc., are considered useful selectable markers for E. coli. The normal E. coli cells do not carry resistance against any of these antibiotics.
Figure 11.4 E. coli cloning vector pBR322 showing restriction sites (Hind III, EcoR I, BamH I, Sal I, Pvu II, Pst I, Cla I), ori and antibiotic resistance genes (ampR and tetR). rop codes for the proteins involved in the replication of the plasmid.
(iii) Cloning sites: In order to link the alien DNA, the vector needs to have very few, preferably single, recognition sites for the commonly used restriction enzymes. Presence of more than one recognition sites within the vector will generate several fragments, which will complicate the gene cloning (Figure 11.4). The ligation of alien DNA is carried out at a restriction site present in one of the two antibiotic resistance genes. For example, you can ligate a foreign DNA at the BamH I site of tetracycline resistance gene in the vector pBR322. The recombinant plasmids will lose tetracycline resistance due to insertion of foreign DNA but can still be selected out from non-recombinant ones by plating the transformants on tetracycline containing medium. The transformants growing on ampicillin containing medium are then transferred on a medium containing tetracycline. The recombinants will grow in ampicillin containing medium but not on that containing tetracycline. But, non- recombinants will grow on the medium containing both the antibiotics. In this case, one antibiotic resistance gene helps in selecting the transformants, whereas the other antibiotic resistance gene gets ‘inactivated due to insertion’ of alien DNA, and helps in selection of recombinants. Selection of recombinants due to inactivation of antibiotics is a cumbersome procedure because it requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics. Therefore, alternative selectable markers have been developed which differentiate recombinants from non-recombinants on the basis of their ability to produce colour in the presence of a chromogenic substrate. In this, a recombinant DNA is inserted within the coding sequence of an enzyme, β-galactosidase. This results into inactivation of the gene for synthesis of this enzyme, which is referred to as insertional inactivation. The presence of a chromogenic substrate gives blue coloured colonies if the plasmid in the bacteria does not have an insert. Presence of insert results into insertional inactivation of the β-galactosidase gene and the colonies do not produce any colour, these are identified as recombinant colonies.
(iv) Vectors for cloning genes in plants and animals : You may be surprised to know that we have learnt the lesson of transferring genes into plants and animals from bacteria and viruses which have known this for ages - how to deliver genes to transform eukaryotic cells and force them to do what the bacteria or viruses want. For example, Agrobacterium tumifaciens, a pathogen of several dicot plants is able to deliver a piece of DNA known as ‘ T-DNA’ to transform normal plant cells into a tumor and direct these tumor cells to produce the chemicals required by the pathogen. Similarly, retroviruses in animals have the ability to transform normal cells into cancerous cells. A better understanding of the art of delivering genes by pathogens in their eukaryotic hosts has generated knowledge to transform these tools of pathogens into useful vectors for delivering genes of interest to humans. The tumor inducing (Ti) plasmid of Agrobacterium tumifaciens has now been modified into a cloning vector which is no more pathogenic to the plants but is still able to use the mechanisms to deliver genes of our interest into a variety of plants. Similarly, retroviruses have also been disarmed and are now used to deliver desirable genes into animal cells. So, once a gene or a DNA fragment has been ligated into a suitable vector it is transferred into a bacterial, plant or animal host (where it multiplies).
11.2.3 Competent Host (For Transformation with Recombinant DNA)
Since DNA is a hydrophilic molecule, it cannot pass through cell membranes. Why? In order to force bacteria to take up the plasmid, the bacterial cells must first be made ‘competent’ to take up DNA. This is done by treating them with a specific concentration of a divalent cation, such as calcium, which increases the efficiency with which DNA enters the bacterium through pores in its cell wall. Recombinant DNA can then be forced into such cells by incubating the cells with recombinant DNA on ice, followed by placing them briefly at 420C (heat shock), and then putting them back on ice. This enables the bacteria to take up the recombinant DNA.
This is not the only way to introduce alien DNA into host cells. In a method known as micro-injection, recombinant DNA is directly injected into the nucleus of an animal cell. In another method, suitable for plants, cells are bombarded with high velocity micro-particles of gold or tungsten coated with DNA in a method known as biolistics or gene gun. And the last method uses ‘disarmed pathogen’ vectors, which when allowed to infect the cell, transfer the recombinant DNA into the host.
Now that we have learnt about the tools for constructing recombinant DNA, let us discuss the processes facilitating recombinant DNA technology.
11.3 PROCESSES OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY
Recombinant DNA technology involves several steps in specific sequence such as isolation of DNA, fragmentation of DNA by restriction endonucleases, isolation of a desired DNA fragment, ligation of the DNA fragment into a vector, transferring the recombinant DNA into the host, culturing the host cells in a medium at large scale and extraction of the desired product. Let us examine each of these steps in some details.
11.3.1 Isolation of the Genetic Material (DNA)
Recall that nucleic acid is the genetic material of all organisms without exception. In majority of organisms this is deoxyribonucleic acid or DNA. In order to cut the DNA with restriction enzymes, it needs to be in pure form, free from other macro-molecules. Since the DNA is enclosed within the membranes, we have to break the cell open to release DNA along with other macromolecules such as RNA, proteins, polysaccharides and also lipids. This can be achieved by treating the bacterial cells/plant or animal tissue with enzymes such as lysozyme (bacteria), cellulase (plant cells), chitinase (fungus). You know that genes are located on long molecules of DNA interwined with proteins such as histones. The RNA can be removed by treatment with ribonuclease whereas proteins can be removed by treatment with protease. Other molecules can be removed by appropriate treatments and purified DNA ultimately precipitates out after the addition of chilled ethanol. This can be seen as collection of fine threads in the suspension (Figure 11.5).
Figure 11.5 DNA that separates out can be removed by spooling
11.3.2 Cutting of DNA at Specific Locations
Restriction enzyme digestions are performed by incubating purified DNA molecules with the restriction enzyme, at the optimal conditions for that specific enzyme. Agarose gel electrophoresis is employed to check the progression of a restriction enzyme digestion. DNA is a negatively charged molecule, hence it moves towards the positive electrode (anode) (Figure 11.3). The process is repeated with the vector DNA also.
The joining of DNA involves several processes. After having cut the source DNA as well as the vector DNA with a specific restriction enzyme, the cut out ‘gene of interest’ from the source DNA and the cut vector with space are mixed and ligase is added. This results in the preparation of recombinant DNA.
11.3.3 Amplification of Gene of Interest using PCR
PCR stands for Polymerase Chain Reaction. In this reaction, multiple copies of the gene (or DNA) of interest is synthesised in vitro using two sets of primers (small chemically synthesised oligonucleotides that are complementary to the regions of DNA) and the enzyme DNA polymerase. The enzyme extends the primers using the nucleotides provided in the reaction and the genomic DNA as template. If the process of replication of DNA is repeated many times, the segment of DNA can be amplified to approximately billion times, i.e., 1 billion copies are made. Such repeated amplification is achieved by the use of a thermostable DNA polymerase (isolated from a bacterium, Thermus aquaticus), which remain active during the high temperature induced denaturation of double stranded DNA. The amplified fragment if desired can now be used to ligate with a vector for further cloning (Figure11.6).
Figure 11.6 Polymerase chain reaction (PCR) : Each cycle has three steps: (i) Denaturation; (ii) Primer annealing; and (iii) Extension of primers
11.3.4 Insertion of Recombinant DNA into the Host Cell/Organism
There are several methods of introducing the ligated DNA into recipient cells. Recipient cells after making them ‘competent’ to receive, take up DNA present in its surrounding. So, if a recombinant DNA bearing gene for resistance to an antibiotic (e.g., ampicillin) is transferred into E. coli cells, the host cells become transformed into ampicillin-resistant cells. If we spread the transformed cells on agar plates containing ampicillin, only transformants will grow, untransformed recipient cells will die. Since, due to ampicillin resistance gene, one is able to select a transformed cell in the presence of ampicillin. The ampicillin resistance gene in this case is called a selectable marker.
11.3.5 Obtaining the Foreign Gene Product
When you insert a piece of alien DNA into a cloning vector and transfer it into a bacterial, plant or animal cell, the alien DNA gets multiplied. In almost all recombinant technologies, the ultimate aim is to produce a desirable protein. Hence, there is a need for the recombinant DNA to be expressed. The foreign gene gets expressed under appropriate conditions. The expression of foreign genes in host cells involve understanding many technical details.
After having cloned the gene of interest and having optimised the conditions to induce the expression of the target protein, one has to consider producing it on a large scale. Can you think of any reason why there is a need for large-scale production? If any protein encoding gene is expressed in a heterologous host, it is called a recombinant protein. The cells harbouring cloned genes of interest may be grown on a small scale in the laboratory. The cultures may be used for extracting the desired protein and then purifying it by using different separation techniques.
The cells can also be multiplied in a continuous culture system wherein the used medium is drained out from one side while fresh medium is added from the other to maintain the cells in their physiologically most active log/exponential phase. This type of culturing method produces a larger biomass leading to higher yields of desired protein.
Small volume cultures cannot yield appreciable quantities of products. To produce in large quantities, the development of bioreactors, where large volumes (100-1000 litres) of culture can be processed, was required. Thus, bioreactors can be thought of as vessels in which raw materials are biologically converted into specific products, individual enzymes, etc., using microbial plant, animal or human cells. A bioreactor provides the optimal conditions for achieving the desired product by providing optimum growth conditions (temperature, pH, substrate, salts, vitamins, oxygen).
The most commonly used bioreactors are of stirring type, which are shown in Figure 11.7.
Figure 11.7 (a) Simple stirred-tank bioreactor; (b) Sparged stirred-tank bioreactor through which sterile air bubbles are sparged
A stirred-tank reactor is usually cylindrical or with a curved base to facilitate the mixing of the reactor contents. The stirrer facilitates even mixing and oxygen availability throughout the bioreactor. Alternatively air can be bubbled through the reactor. If you look at the figure closely you will see that the bioreactor has an agitator system, an oxygen delivery system and a foam control system, a temperature control system, pH control system and sampling ports so that small volumes of the culture can be withdrawn periodically.
11.3.6 Downstream Processing
After completion of the biosynthetic stage, the product has to be subjected through a series of processes before it is ready for marketing as a finished product. The processes include separation and purification, which are collectively referred to as downstream processing. The product has to be formulated with suitable preservatives. Such formulation has to undergo thorough clinical trials as in case of drugs. Strict quality control testing for each product is also required. The downstream processing and quality control testing vary from product to product.
Summary
Biotechnology deals with large scale production and marketing of products and processes using live organisms, cells or enzymes. Modern biotechnology using genetically modified organisms was made possible only when man learnt to alter the chemistry of DNA and construct recombinant DNA. This key process is called recombinant DNA technology or genetic engineering. This process involves the use of restriction endonucleases, DNA ligase, appropriate plasmid or viral vectors to isolate and ferry the foreign DNA into host organisms, expression of the foreign gene, purification of the gene product, i.e., the functional protein and finally making a suitable formulation for marketing. Large scale production involves use of bioreactors.
EXERCISES
1. Can you list 10 recombinant proteins which are used in medical practice? Find out where they are used as therapeutics (use the internet).
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Answer
Recombinant proteins are obtained from the recombinant DNA technology. This technology involves the transfer of specific genes from an organism into another organism using vectors and restriction enzymes as molecular tools.
Ten recombinant proteins used in medical practice are -
| Recombinant protein | Therapeutic use | |
|---|---|---|
| 1. | Insulin | Treatment for type I diabetes mellitus |
| 2. | Interferon- $\alpha$ | Used for chronic hepatitis C |
| 3. | Interferon -Ã $\tilde{Z}^{2}{ }^{2}$ | Used for herpes and viral enteritis |
| 4. | Coagulation factor VII | Treatment of haemophilia A |
| 5. | Coagulation factor IX | Treatment of haemophilia B |
| 6. | DNAase I | Treatment of cystic fibrosis |
| 7. | Anti-thrombin III | Prevention of blood clot |
| 8. | Interferon B. | For treatment of multiple sclerosis |
| 9. | Human recombinant growth hormone | For promoting growth in an individual |
| 10. | Tissue plasminogen activator | Treatment of acute myocardial infection |
2. Make a chart (with diagrammatic representation) showing a restriction enzyme, the substrate DNA on which it acts, the site at which it cuts DNA and the product it produces.
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Answer
The name of the restriction enzyme is Bam $\mathrm{H} 1$.
Site at which BAM H1 cuts DNA
3. From what you have learnt, can you tell whether enzymes are bigger or DNA is bigger in molecular size? How did you know?
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Answer
Enzymes are smaller in size than DNA molecules. This is because DNA contains genetic information for the development and functioning of all living organisms. It contains instructions for the synthesis of proteins and DNA molecules. On the other hand, enzymes are proteins which are synthesised from a small stretch of DNA known as ‘genes’, which are involved in the production of the polypeptide chain.
4. What would be the molar concentration of human DNA in a human cell? Consult your teacher.
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Answer
The molar concentration of human DNA in a human diploid cell is as follows:
$\Rightarrow$ Total number of chromosomes $\times 6.023 \times 10^{23}$
$\Rightarrow 46 \times 6.023 \times 10^{23}$
$\Rightarrow 2.77 \times 10^{18}$ Moles
Hence, the molar concentration of DNA in each diploid cell in humans is $2.77 \times 10^{23}$ moles.
5. Do eukaryotic cells have restriction endonucleases? Justify your answer.
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Answer
No, eukaryotic cells do not have restriction endonucleases. This is because the DNA of eukaryotes is highly methylated by a modification enzyme, called methylase. Methylation protects the DNA from the activity of restriction enzymes. These enzymes are present in prokaryotic cells where they help prevent the invasion of DNA by virus.
6. Besides better aeration and mixing properties, what other advantages do stirred tank bioreactors have over shake flasks?
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Answer
The shake flask method is used for a small-scale production of biotechnological products in a laboratory. On the other hand, stirred tank bioreactors are used for a large-scale production of biotechnology products.
Stirred tank bioreactors have several advantages over shake flasks:
(1) Small volumes of culture can be taken out from the reactor for sampling or testing.
(2) It has a foam breaker for regulating the foam.
(3) It has a control system that regulates the temperature and $\mathrm{pH}$.
7. Collect 5 examples of palindromic DNA sequences by consulting your teacher. Better try to create a palindromic sequence by following base-pair rules.
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Answer
The palindromic sequence is a certain sequence of the DNA that reads the same whether read from $5^{\prime} \rightarrow 3^{\prime}$ direction or from $3 \rightarrow 5$ direction. They are the site for the action of restriction enzymes. Most restriction enzymes are palindromic sequences.
Five examples of palindromic sequences are:
(1)
(2)
(3)
(4)
8. Can you recall meiosis and indicate at what stage a recombinant DNA is made?
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Answer
Meiosis is a process that involves the reduction in the amount of genetic material. It is two types, namely meiosis I and meiosis II. During the pachytene stage of prophase I, crossing over of chromosomes takes place where the exchange of segments between non-sister chromatids of homlogous chromosomes takes place. This results in the formation of recombinant DNA.
9. Can you think and answer how a reporter enzyme can be used to monitor transformation of host cells by foreign DNA in addition to a selectable marker?
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Answer
A reporter gene can be used to monitor the transformation of host cells by foreign DNA. They act as a selectable marker to determine whether the host cell has taken up the foreign DNA or the foreign gene gets expressed in the cell. The researchers place the reporter gene and the foreign gene in the same DNA construct. Then, this combined DNA construct is inserted in the cell. Here, the reporter gene is used as a selectable marker to find out the successful uptake of genes of interest (foreign genes). An example of reporter genes includes lac Z gene, which encodes a green fluorescent protein in a jelly fish.
10. Describe briefly the following:
(a) Origin of replication
(b) Bioreactors
(c) Downstream processing
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Answer
(a) Origin of replication -Origin of replication is defined as the DNA sequence in a genome from where replication initiates. The initiation of replication can be either uni-directional or bi-directional. A protein complex recognizes the ‘on’ site, unwinds the two strands, and initiates the copying of the DNA.
(b) Bioreactors - Bioreactors are large vessels used for the large-scale production of biotechnology products from raw materials. They provide optimal conditions to obtain the desired product by providing the optimum temperature, $\mathrm{pH}$, vitamin, oxygen, etc. Bioreactors have an oxygen delivery system, a foam control system, a PH, a temperature control system, and a sampling port to obtain a small volume of culture for sampling.
(c) Downstream processing - Downstream processing is a method of separation and purification of foreign gene products after the completion of the biosynthetic stage. The product is subjected to various processes in order to separate and purify the product. After downstream processing, the product is formulated and is passed through various clinical trials for quality control and other tests.
11. Explain briefly
(a) PCR
(b) Restriction enzymes and DNA
(c) Chitinase
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Answer
(a) PCR: - Polymerase chain reaction (PCR) is a technique in molecular biology to amplify a gene or a piece of DNA to obtain its several copies. It is extensively used in the process of gene manipulation. The process involves invitrosynthesis of sequences using a primer, a template strand, and a thermostable DNA polymerase enzyme obtained from a bacterium, called Thermus aquaticus. The enzyme utilizes building blocks dNTPs (deoxynucleotides) to extend the primer. In the first step, the double stranded DNA molecules are heated to a high temperature so that the two strands separate into a single stranded DNA molecule. This process is called denaturation. Then, this ssDNA molecule is used as a template strand for the synthesis of a new strand by the DNA polymerase enzyme and this process is called annealing, which results in the duplication of the original DNA molecule. This process is repeated over several cycles to obtain multiple copies of the rDNA fragment.
(A)
(b) Restriction enzymes are molecular scissors used in molecular biology for cutting DNA sequences from a specific site. It plays an important role in gene manipulation. The enzymes recognize a specific six-box pair sequence known as the recognition sequence and cut the sequence at a specific site. For example, the recognition site for enzyme ECORI is as follows:
Restriction enzyme are categorized into two types -
(i) Exonuclease - It is a type of restriction enzyme that removes the nucleotide from either 5 or 3 ends of the DNA molecule.
(ii) Endonuclease - It is a type of restriction enzyme that makes a cut within the DNA at a specific site. This enzyme acts as an important tool in genetic engineering. It is commonly used to make a cut in the sequence to obtain DNA fragments with sticky ends, which are later joined by enzyme DNA ligase. (c) Chitinase - Chitinase is a class of enzymes used for the degradation of chitin, which forms a major component of the fungal cell wall. Therefore, to isolate the DNA enclosed within the cell membrane of the fungus, enzyme chitinase is used to break the cell for releasing its genetic material.
12. Discuss with your teacher and find out how to distinguish between
(a) Plasmid DNA and Chromosomal DNA
(b) RNA and DNA
(c) Exonuclease and Endonuclease
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Answer
(a) Plasmid DNA and chromosomal DNA
| Plasmid DNA | Chromosomal DNA |
|---|---|
| Plasmid DNA is an extra-chromosomal DNA molecule in bacteria that is capable of replicating, independent of chromosomal DNA. |
Chromosomal DNA is the entire DNA of an organism present inside chromosomes. |
(b) RNA and DNA
| RNA | DNA | |
|---|---|---|
| 1. | RNA is a single stranded molecule. | DNA is a double stranded molecule. |
| 2. | It contains ribose sugar. | It contains deoxyribose sugar. |
| 3. | The pyrimidines in RNA are adenine and uracil. | The pyrimidines in DNA are adenine and thymine. |
| 4 | RNA cannot replicate itself. | DNA molecules have the ability to replicate. |
| 5 | It is a component of the ribosomes. | It is a component of the chromosomes. |
(c) Exonuclease and Endonuclease
| Exonuclease | Endonuclease |
|---|---|
| It is a type of restriction enzyme that removes the nucleotide from 5 or 3 ends of the DNA molecule. |
It is a type of restriction enzyme that makes a cut within the DNA at a specific site to generate sticky ends. |
जैव प्रौद्योगिकी (बायोटेक्नॉलजी) में उन तकनीकों का वर्णन मिलता है जिसमें जीवधारियों या उनसे प्राप्त एंजाइमों का उपयोग करते हुए मनुष्य के लिए उपयोगी उत्पाद या प्रक्रमों (प्रोसेस) का विकास किया जाता है। डबल रोटी, शराब इत्यादि सभी, सूक्ष्म जीवों द्वारा संपन्न प्रक्रमों से बनते हैं। यह भी एक प्रकार से जैव प्रौद्योगिकी का परिणाम है। वर्तमान समय में, सीमित अर्थ में जैव प्रौद्योगिकी को देखा जाए तो इनमें वे प्रक्रम आते हैं; जिनमें आनुवंशिकतः रूपांतरित (जेनेटिकली मोडीफाइड) जीवों का उपयोग उपर्युक्त पदार्थों को अधिक मात्रा में उत्पादन के लिए किया जाता है। आगे चलकर अनेक प्रक्रमों / तकनीकों का समावेश जैव प्रौद्योगिकी में किया गया। उदाहरणार्थ- पात्रे (इन वीट्रो) निषेचन द्वारा परखनली शिशु का निर्माण, जीन का संश्लेषण एवं उपयोग, डीएनए टीका का निर्माण या दोषयुक्त जीन का सुधार, ये सभी जैव प्रौद्योगिकी के ही भाग हैं।
यूरोपीय जैव प्रौद्योगिकी संघ ( इ एफ बी) द्वारा जो जैव प्रौद्योगिकी की परिभाषा दी गयी है, उसमें दोनों परंपरागत विचार व आधुनिक आणविक जैव प्रौद्योगिकी का समावेश है। इ एफ बी द्वारा दी गयी परिभाषा निम्नवत् है- ‘नए उत्पादों तथा सेवाओं के लिए। प्राकृतिक विज्ञान व जीवों कोशिकाओं व इसके अंग तथा आणविक अनुरूपों का समायोजन।
9.1 जैव प्रौद्योगिकी के सिद्धांत
आधुनिक जैव प्रौद्योगिकी के विकास में निम्न दो प्रमुख तकनीकों का योगदान है। ये हैं;
(क) आनुवंशिक इंजीनियरिंग- इस तकनीक द्वारा आनुवंशिक पदार्थो (डीएनए या आरएनए) के रसायन में कर इसे परपोषी जीवों (होस्ट आर्गेनिज्म) में प्रवेश कराकर इसके समलक्षणी (फीनोटाइप) में परिवर्तन करते हैं।
(ख) जैव प्रक्रम रासायनिक इंजीनियरिंग प्रक्रमों में रोगाणुरहित (सूक्ष्म जीव संदूषण रहित) वातावरण बनाकर केवल वांछित सूक्ष्मजीवों / सुकेंद्रकी कोशिकाओं में वृद्धिकर अधिक मात्रा में जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों जैसे- प्रतिजैविकों (एंटीबॉयोटिक), टीके, एंजाइमों आदि का निर्माण किया जाता है।
अब आनुवंशिक इंजीनियरिंग के सिद्धांतों के संकल्पनात्मक विकास के बारे में अध्ययन करेंगे। संभवतः आप अलैंगिक जनन (रिप्रोडेक्शन) की अपेक्षा लैंगिक जनन के फायदों के बारे में जानते हैं। अलैंगिक जनन आनुवंशिकी सूचनाओं को परिरक्षित रखता है जबकि लैंगिक जनन द्वारा विभिन्नता व विशिष्ट आनुवंशिक व्यवस्था के संयोजन के प्रतिपादन का अवसर मिलता है जो जीव या आबादी हेतु लाभकारी हो सकता है। लैंगिक जनन से विभिन्नता उत्पन्न होती है। परंपरागत संकरण की विधियाँ जो पौधों एवं जंतुओं के जनन में उपयोगी है, इनके द्वारा वांछित जीन के साथ-साथ अवांछित जीन का समावेश व गुणन भी हो जाता है। उपर्युक्त कमियों को दूर करने हेतु आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों में जीन क्लोनिंग एवं जीन स्थानांतरण का उपयोग कर पुनर्योगज डीएनए (रीकॉम्बीनेंट डीएनए) का निर्माण किया जाता है जिससे, बिना अवांछित जीनों के केवल एक या एक से अधिक वांछित जीन को चुने हुए जीवों में स्थानांतरित करते हैं।
क्या आप जानते हैं कि विजातीय (एलियन) जीवों में किसी प्रकार से स्थानांतरित किए हुए डीएनए खंड का क्या भविष्य है? संभवतः यह डीएनए जीव की संतति कोशिकाओं में स्वयं गुणित नहीं हो पाएगा। किंतु, जब यह डीएनए आदाता (ग्राही) के जीनोम में जुड़ जाता है तब यह गुणित होकर परपोषी डीएनए के साथ वंशागत हो जाता है। यह विजातीय डीएनए खंड, गुणसूत्र का अंग हो जाता है जिसमें प्रतिकृति करने की क्षमता होती है। एक गुणसूत्र में एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम होता है जिसे प्रतिकृतीयन (रेप्लिकेशन ) का उत्पत्ति कहते हैं और जो प्रतिकृतियन के लिए उत्तरदायी हैं। किसी भी जीव में किसी विजातीय डीएनए खंड के गुणन हेतु इसे गुणसूत्र का अंग होना आवश्यक है जिसमें एक विशिष्ट अनुक्रम मिलता है जिसे ‘प्रतिकृति का मूल (औरिजिन ऑफ रेप्लीकेशन)’ कहते हैं। इस प्रकार एक विजातीय डीएनए प्रतिकृति के मूल से जुड़ा रहता है, ताकि डीएनए का विजातीय खंड परपोषी जीव में स्वयं प्रतिकृति व गुणित हो सके। इसे क्लोनिंग भी कह सकते हैं या किसी टेम्पलेट डीएनए की समान गुणित संरचना का निर्माण कह सकते हैं।
अब एक कृत्रिम पुनर्योगज डीएनए अणु के निर्माण के बारे में अध्ययन करेंगे। प्रथम पुनर्योगज डीएनए का निर्माण सालमोनेला टाइफीमूरियम के सहज प्लाज्मिड (यह गोलाकार गुणसूत्र बाह्य डीएनए है जो स्वतः प्रतिकृति करता है।) में प्रतिजैविक प्रतिरोधी कूटलेखन जीन के जुड़ने से हो सका था। स्टेनले कोहेन व हरबर्ट बोयर ने 1972 में उपर्युक्त कार्य प्लाज्मिड से डीएनए का टुकड़ा काटकर संपन्न किया जिनमें प्रतिजैविक प्रतिरोध प्रदान करने के लिए जिम्मेदार जीन था। आणविक कैंची कहे जाने वाले ‘प्रतिबंधन एंजाइम्स’ (रिस्ट्रिक्सन एंजाइम) की खोज से डीएनए को विशिष्ट जगहों पर काटना संभव हो सका। कटे हुए डीएनए का भाग प्लाज्मिड डीएनए से जोड़ा जाता है। यह प्लाज्मिड डीएनए संवाहक (वेक्टर) की तरह कार्य करता है जो इससे जुड़े डीएनए को स्थानांतरित करता है। संभवतः आप जानते हो कि मच्छर, कीट संवाहक के रूप में मलेरिया परजीवी को मनुष्य शरीर में स्थानांतरित करता है। ठीक उसी तरह से प्लाज्मिड को संवाहक के रूप में प्रयोगकर विजातीय डीएनए के खंड को परपोषी जीवों में पहुँचाया जाता है। प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन को संवाहक के साथ जोड़ने का काम एंजाइम डीएनए लाइगेज के द्वारा होता है जो डीएनए अणु के कटे हुए भाग पर कार्य कर उसके किनारों को जोड़ने का काम करता है। इस संयोजन से पात्रे (इन विट्रो) नये गोलाकार स्वतः प्रतिकृति बनाने वाले डीएनए का निर्माण होता है जिसे पुर्नयोगज डीएनए कहते हैं। जब यह डीएनए एशरिकिआ कोलाई (ई.कोलाई) (एक जीवाणु जो सालमोनेल से काफी मिलता-जुलता है) में स्थानांतरित किया जाता है तो यह नए परपोषी के डीएनए पॉलिमरेज एंजाइम का उपयोग कर अनेक प्रतिकृतियाँ बना लेता है। प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन की प्रति का ई.कोलाई का गुणन, ई.कोलाई में प्रति जैविक प्रतिरोधी जीन की क्लोनिंग कहलाता है।
आप अनुमान लगा सकते हैं कि जीव के आनुवंशिक रूपांतर में मूलभूत तीन चरण हैं-
(क) वांछित जीन युक्त डीएनए की पहचान
(ख) चिह्नित डीएनए का परपोषी में स्थानांतरण
(ग) स्थानांतरित डीएनए को परपोषी में सुरक्षित रखना तथा उसकी संतति में स्थानांतरित करना।
9.2 पुनर्योगज डीएनए तकनीक के साधन
अब हम पूर्ववर्णित चर्चा से जान चुके हैं कि आनुवंशिक इंजीनियरिंग या पुनर्योगज डीएनए तकनीक तभी संपादित हो सकती जब हमारे पास तकनीकी साधन जैसे प्रतिबंधन एंजाइम, पॉलिमरेज एंजाइम, लाइगेज, संवाहक व परपोषी जीव हों। अब इनमें से कुछ के बारे में विस्तृत अध्ययन करेंगे।
9.2.1 प्रतिबंधन एंजाइम
वर्ष 1963 में दो एंजाइम पृथक किए गए जो ई.कोलाई में जीवाणु भोजी (बैक्टीरियोफाज) की वृद्धि को रोक देते है। इनमें एक डीएनए से मिथिल समूह को जोड़ता है, जबकि दूसरा डीएनए को काटता है। बाद वाले एंजाइम को प्रतिबंधन एंडोन्युक्लिएज कहा गया।
प्रथम प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लियेज- हिंड II, जिसका कार्य डीएनए न्यूक्लियोटाइड विशिष्ट क्रम पर निर्भर है। यह पाँच वर्ष बाद पृथक किया और पहचाना गया। ऐसा पाया गया कि हिंड II, डीएनए अणु को उस विशेष बिंदु पर काटते हैं जहाँ पर छह क्षारक युग्मों (बेस पेयर) का एक विशेष अनुक्रम होता है। इस विशिष्ट क्षारक अनुक्रम को हिंड II, को पहचान अनुक्रम कहते हैं। हिंड II, के अलावा आज 900 से अधिक प्रतिबंधन एंजाइमों के बारे में जानकारी है जो जीवाणुओं के 230 से अधिक प्रभेदों (स्ट्रिंस) से पृथक किए गए हैं; जिनमें से प्रत्येक विभिन्न पहचान अनुक्रमों को पहचानते हैं।
इन एंजाइमों के नामकरण में परंपरानुसार नाम का पहला शब्द वंश व दूसरा एवं तीसरा शब्द प्राकेंद्रकी कोशिकाओं की जाति से लिया गया है, जिनसे ये पृथक किए गए थे। जैसे-ईको आर I (EcoRI) एशरिशिया कोलाई आर वाई 13, ईको आर I में वर्ण ‘आर $(\mathrm{R})$ ’ प्रभेद के नाम से लिया गया है। नाम के बाद रोमन अंक उस क्रम को दर्शाते हैं जिसको जीवाणु के प्रभेद से एंजाइम पृथक किए गए थे।
प्रतिबंधन एंजाइम, न्यूक्लिएजेज कहलाने वाले एंजाइमों के बड़े वर्ग में आते हैं। एक्सोन्यूक्लिएज दो प्रकार के होते हैं- एवं एंडोन्यूक्लिएज एक्सोन्यूक्लिएज डीएनए के सिरे से न्यूक्लियोटाइड को अलग करते हैं, जबकि एंडोन्यूक्लिएज डीएनए को भीतर विशिष्ट स्थलों पर काटते हैं।
प्रत्येक प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज डीएनए अनुक्रम की लंबाई के ‘निरीक्षण’ के बाद कार्य करता है। जब यह अपना विशिष्ट पहचान अनुक्रम पा जाता है तब यह डीएनए से जुड़ता है तथा द्विकुंडलिनी की दोनों लड़ियों को शर्करा-फॉस्फेट आधारस्तंभों में विशिष्ट केंद्रों पर काटता है (चित्र 9.1) प्रत्येक प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज डीएनए में विशिष्ट पैलीन्डोमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को पहचानता है।
चित्र 9.1 प्रतिबंधन एंजाइम - इको आर वन (EcoR1) की क्रिया द्वारा पुनर्योगज डीएनए के निर्माण के चरण
क्या आप जानते हो कि पैलिंड्रोम क्या हैं? ये वर्णों के समूह हैं जिन्हें आगे व पीछे दोनों तरफ से पढ़ने पर एक ही शब्द बनता है जैसे ‘मलयालम’। शब्द पैलिंड्रोम और डीएनए पैलिंड्रोम में अंतर है। डीएनए में पैलिंड्रोम क्षारक युग्मों का एक ऐसा अनुक्रम होता है जो पढ़ने के अभिविन्यास को समान रखने पर दोनों लड़ियों में एक जैसे पढ़ा जाता है। उदाहरणार्थ- निम्न अनुक्रमों को ’ $5 \rightarrow 3$ ’ दिशा में पढ़ने पर दोनों लड़ियों में एक जैसा पढ़ा जाएगा। अगर इसे $3^{\prime} \rightarrow 5^{\prime}$ दिशा में पढ़ा जाए तब भी यह बात सही बैठती है-
$ \begin{aligned} 5^{\prime}—– \text { GAATTC }—– 3^{\prime} \\ 3^{\prime}—–\text { CTTAAG }—–5^{\prime} \end{aligned} $
प्रतिबंधन एंजाइम डीएनए लड़ी को पैलिंड्रोम स्थल के केंद्र से थोड़ी दूरी पर लेकिन विपरीत लड़ियों में दो समान क्षारकों के बीच काटते हैं। जिसके फलस्वरूप सिरों पर एक लड़ीय भाग रह जाता है। प्रत्येक लड़ी में प्रलंबी फैलाव मिलते हैं जिन्हें चिपचिपा (स्टिकी) सिरा कहते हैं (चित्र 9.1)। इसे यह नाम इसलिए दिया गया है क्योंकि यह अपने पूरक कटे प्रतिरूप के साथ हाइड्रोजन आबंध (बॉन्ड) बनाते हैं। सिरों का यह चिपचिपापन एंजाइम डीएनए लाइगेज के कार्य में सहायता प्रदान करता है।
प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज का उपयोग आनुवंशिक इंजीनियरिंग में डीएनए के पुनर्योगज अणु बनाने में किया जाता है जो विभिन्न स्रोतों या जीनोमों से प्राप्त डीएनए से मिलकर बना होता है।
एक ही प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा काटने पर प्राप्त होने वाले डीएनए खंडों में समान प्रकार को ‘चिपचिपे सिरे’ होते हैं, जो डीएनए लाइगेज की सहायता से आपस में (किनारे से किनारा) जुड़ जाते हैं (चित्र 9.2)
चित्र 9.2 पुनर्योगज डीएनए तकनीक का आरेखीय प्रदर्शन
आप पूर्ण रूप से समझ चुके होंगे कि सामान्यतः जब तक संवाहक व स्रोत डीएनए एक ही प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा नहीं काटे जाते हैं तब तक पुनर्योगज संवाहक अणु का निर्माण नहीं हो सकता है।
डीएनए खंड का पृथक्करण एवं विलगन- प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज द्वारा डीएनए को काटने के परिणामस्वरूप डीएनए का खंडन हो जाता है। इन खंडों को एक तकनीक द्वारा अलग कर सकते हैं जिसे जेल वैद्युत का संचलन ( इलेक्ट्रोफोरेसिस ) कहते हैं। चूँकि डीएनए खंड ऋणात्मक आवेशित (चार्जड) अणु होते हैं, इसलिए इन्हें विद्युत क्षेत्र में माध्यम / आधात्री द्वारा ऐनोड की तरफ बलपूर्वक भेजकर अलग कर सकते हैं। आजकल बहुत ही सामान्य रूप से उपयोग किया जाने वाला माध्यम, ऐगारोज है जो समुद्रीय घास (सी वीडस) से निकाला गया एक प्राकृतिक बहुलक (पॉलिमर) है। डीएनए खंडों को ऐगारोज जेल के छलनी प्रभाव द्वारा उनके आकार के अनुसार अलग करते हैं। इस कारण खंड जितने छोटे आकार के होंगे, वे अधिक दूर तक जायेंगे। चित्र 9.3 देखिए और अनुमान लगाइए कि जेल के किस सिरे पर प्रतिदर्श (सेंपल) लादा गया था।
चित्र 9.3 एक प्रारूपी एगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस जो असार संग्रही ( पथ 1) व सार संग्रही डीएनए खंडों के समूह का स्थानांतरण प्रदर्शित करता है (पथ 2 से 4 )
पृथक्कृत डीएनए खंडों को तभी देख सकते हैं जब इस डीएनए को इथीडियम ब्रोमाइड नामक यौगिक से अभिरंजित कर पराबैंगनी विकिरणों से अनावृत्त करते हैं। (आप शुद्ध डीएनए खंडों को दृश्य प्रकाश में बिना अभिरंजित किए नहीं देख सकते।) इथीडियम ब्रोमाइड अभिरंजित (स्टेन्ड) जेल को पराबैंगनी प्रकाश से अनावृत्त करने पर डीएनए की चमकीली नारंगी रंग की पट्टी दिखाई पड़ती है (चित्र 9.3)। डीएनए की पृथक्कृत पट्टियों को ऐगारोज जेल से काट कर निकालते हैं और जेल के टुकड़ों से निष्कर्षित (एक्सट्रेक्ट) कर लेते हैं। इस प्रक्रिया को क्षालन (इलूसन) के कहते हैं। इस तरह से शुद्ध किए गए डीएनए को क्लोनिंग संवाहक से जोड़कर, पुनर्योगज डीएनए निर्माण में उपयोग किया जाता है।
9.2.2 क्लोनिंग संवाहक
आप जानते ही हैं कि प्लाज्मिड व जीवाणुभोजी, जीवाणु कोशिकाओं में, बिना गुणसूत्रीय डीएनए नियंत्रण के स्वतंत्र रूप से प्रतिकृति करने की क्षमता रखते हैं। जीवाणुभोजियों की प्रत्येक कोशिका में काफी अधिक संख्या होने से जीवाणु कोशिका में इनके जीनोम की कई प्रतिकृति मिलती है। कुछ प्लाज्मिड की, प्रतिकोशिका केवल एक या दो जबकि दूसरों की 15 से 100 प्रतिकृति मिलती है। इनकी संख्या इससे भी ज्यादा हो सकती है। यदि हम विजातीय डीएनए खंड को जीवाणुभोजी या प्लाज्मिड डीएनए के साथ जोड़ सकें तो इनकी संख्या को भी जीवाणुभोजी या प्लाज्मिड की प्रतिकृति संख्या के समान गुणित कर सकते हैं। वर्तमान समय में उपयोग किये जा रहे संवाहक इस प्रकार से तैयार किए जाते हैं कि इन्हें बाहरी डीएनए से जोड़ने व अपुनर्योगिजों से पुनर्योगजों के चयन में सहायता मिलती है।
संवाहक में क्लोनिंग करने हेतु निम्न विशेषताओं की आवश्यकता होती है-
(क) प्रतिकृतियन का उत्पत्ति (ori का प्रारंभ) - यह वह अनुक्रम है जहाँ से प्रतिकृतीयन की शुरुआत होती है और जब कोई डीएनए का कोई खंड इस अनुक्रम से जुड़ जाता है तब परपोषी कोशिकाओं के अंदर प्रतिकृति कर सकता है। यह अनुक्रम जोड़े गए डीएनए के प्रतिरूपों की संख्या के नियंत्रण के लिए भी उत्तरदायी है। इसलिए यदि कोई लक्ष्य डीएनए की काफी संख्या प्राप्त करना चाहता है तो इसे ऐसे संवाहक में क्लोन करना चाहिए जिसका मूल (ori) अत्यधिक प्रतिरूप बनाने में सहयोग करता है।
(ख) वरण योग्य चिह्नक — ‘ori’ के साथ संवाहक को वरणयोग्य चिह्नक की आवश्यकता भी होती है, जो अरूपांतरजों (नॉन-ट्रॉन्स्फॉर्मिन्ट्स) की पहचान व उन्हें समाप्त करने में सहायक हो और रूपांतरजों की चयनात्मक वृद्धि को होने दे रूपांतरण (ट्रॉन्स्फार्मेशन) एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा डीएनए के एक खंड को परपोषी जीवाणु में प्रवेश कराते हैं। (आप आगे के खंडों में इस प्रक्रिया का अध्ययन करेंगे)। सामान्यतया एंपिसिलिन, क्लोरैम्फेनिकॉल, टेट्रोसाइक्लीन या केनामाइसीन जैसे प्रतिजैविक (एंटीबॉयोटिक) के प्रति प्रतिरोध कोडित करने (एन्कोडिंग) चि्नक माने जाते हैं। सामान्य ई.कोलाई कोशिकाओं में इनमें से किसी प्रतिजैविक के प्रति, प्रतिरोध नहीं होता।
चित्र 9.4 इ. कोलाई क्लोनिंग संवाहक $\mathrm{pBR} 322$ में प्रतिबंधन स्थल (Hind III, EcoR I, BamH I, Sal I, Pvu II, Pst I, Cla I), ori व प्रतिजैविक वाले जीन ई.कोलाई के लिए उपयोगी वरणयोग्य प्रतिरोधी जीन $\left(\mathbf{a m p}^{\mathrm{R}}\right.$ व $\left.\mathrm{tet}^{\mathrm{R}}\right)$ rop प्लाज्मिड के प्रतिकृति में भाग लेने वाले प्रोटीन का कूट लेखन करता है।
(ग) क्लोनिंग स्थल - विजातीय डीएनए को जोड़ने हेतु सामान्यतः काम में लिए जा रहे प्रतिबंधित एंजाइम के लिए संवाहक में कुछ या एक ही पहचान स्थल होना चाहिए। संवाहक के अंदर एक से अधिक पहचान स्थल होने पर इसके कई खंड बन जाते हैं जो जीन क्लोनिंग को जटिल बना देते हैं। (चित्र 9.4) विजातीय डीएनए का बंधन (लीगेशन) उन दोनों प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीनों में से एक में स्थित प्रतिबंध स्थल पर किया जाता है। उदाहरणार्थ आप विजातीय डीएनए को संवाहक पी बी आर 322 (PBR322) में स्थित टेट्रासाइक्लीन प्रतिरोधी जीन के स्थल से जोड़ सकते हैं। पुनर्योगज प्लाज्मिड का टेट्रासाइक्लीन प्रतिरोध बाहरी डीएनए के निवेशन (इन्सर्शन) से समाप्त हो जाता है लेकिन रूपांतरज को टेट्रासाइक्लीन युक्त माध्यम पर फैलाकर इसका अपुनर्योगज से अभी भी चयन कर सकते हैं। एंपिसिलिन युक्त माध्यम पर वृद्धि करने वाले रूपांतरजों को तब टेट्रासाइक्लीन युक्त माध्यम पर स्थानांतरित कर देते हैं। पुनर्योगज एंपिसिलिन युक्त माध्यम पर तो वर्धन करेगा, लेकिन टेट्रासाइक्लीन युक्त माध्यम पर वर्धन नहीं करेगा। लेकिन अपुनर्योगज दोनों ही प्रतिजैविक युक्त माध्यम पर वर्धन करेगा। इस मामले में एक प्रतिजैविक प्रतिरोधी जीन रूपांतरजों के चुनाव में सहायता करता है जबकि दूसरा प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन विजातीय डीएनए के ‘निवेशन’ से निष्क्रिय’ हो जाता है और पुर्योगजों के चुनाव में सहायता करता है। प्रतिजैविकों के निष्क्रियण के कारण पुर्नयोगज का चयन एक जटिल विधि है क्योंकि इसमें दो प्लेटों, जिसमें भिन्न-भिन्न प्रतिजैविक होता है, पर साथ- साथ प्लेटिंग की जरूरत होती है। इस कारण से वैकल्पिक वरणयोग्य चिह्नकों का विकास हुआ जो पुर्नयोगजों को अपुर्नयोगजों से इस आधार पर विभेद करता है वे वर्णोकोत्पादकी (क्रोमोजेनिक) पदार्थ की उपस्थिति में रंग पैदा करने में सक्षम होते हैं। इसमें एक पुर्योगज डीएनए को बीटा गैलक्टोसाइडेज एंजाइम के कोडिंग अनुक्रम में अन्तर्स्थापित करते हैं, जिससे एन्जाइम संश्लेषित करने वाला जीन निष्क्रिय हो जाता है जिसे निवेशी निष्क्रियता (इनसर्शनल इनएक्टीवेशन) कहते हैं। यदि जीवाणु में प्लाज्मिड में संसर्गिका (इंसर्ट) नहीं होता है तब वर्णोकात्पादकी पदार्थ की उपस्थिति में नीले रंग को निवह (कालोनी) का निर्माण होता है। संसर्गिका की उपस्थिति के परिणामस्वरूप बीटा-गलैक्टोसाइडेस का निवेशी निष्क्रियण हो जाता है जिससे बिना रंग वाली कालोनी बनती है जिसे पुर्नयोगज कालोनी के रूप में पहचानते हैं।
(घ) पौधों व जंतुओं में जीन क्लोनिंग हेतु संवाहक — आपको यह जानकर आश्चर्य होगा कि जीनों को पादप और जंतुओं में स्थानांतरित करना हमने जीवाणुओं और विषाणुओं से सीखा जिन्हें यह बात चिरकाल से पता थी — वे जानते थे कि सुकेंद्रकी (यूकैरियोटिक) कोशिकाओं के रूपांतरित करने के लिए जीनों का कैसे उपयोग किया जाए और वे (जीवाणु तथा विषाणु) जो चाहते हैं वैसा करने के लिए जीनो को बाध्य करते हैं। उदाहरणार्थएग्रोबैक्टीरियम ट्यूमीफेशिएंस कई द्विबीज पत्री पौधों का रोगजनक पैथोजन है। वह डीएनए के एक खंड जिसे ‘टी.-डीएनए’ कहते हैं, को स्थानांतरित कर सामान्य पौधों की कोशिकाओं को अर्बुद (ट्यूमर) में रूपांतरित करता है और ये अर्बुद कोशिकाएँ रोगजनक के लिए जरूरी रसायनों का उत्पादन करते हैं। ठीक इसी तरह से जंतु कोशिकाओं में पश्चविषाणु (रीट्रोवायरस) सामान्य कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं में रूपांतरित कर देते हैं। रोगजनकों द्वारा अपने सुकेंद्रकी परपोषी में जीन स्थानांतरण की कला को अच्छी तरह से समझ कर रोग जनकों की इस विधि का उपयोग कर, अच्छे संवाहक के रूप में प्रयोग कर, मानव के लिए उपयोगी जीन का स्थानांतरण कर सकते हैं। एग्रोवैक्टीरीयम टयूमीफेशियंस का टी आई ( $\mathrm{Ti})$ प्लाज्मिड क्लोनिंग संवाहक के रूप में अब रूपांतरित कर दिया गया है जो पौधों के लिए रोग जनक नहीं है, लेकिन इसका उपयोग अपनी अभिरूचि के जीन को अनेक पौधों में स्थनांतरित करने में किया जाता है। ठीक इसी तरह से पश्चविषाणु को अहानिकारक बनाकर जंतु कोशिकाओं में वांछित जीन को रूपांतरित करने में उपयोग किया जाता है। इस तरह से जब एक जीन या डीएनए के खंड को उचित संवाहक से जोड़ दिया जाता है तब इसे जीवाणु, पौधों व जंतु परपोषी में स्थानांतरित किया जाता है (जहाँ यह गुणित होता रहता है)।
9.2.3 सक्षम परपोषी आतिथेय ( पुनर्योगज डीएनए के साथ रूपांतरण हेतु )
चूँकि डीएनए जलरागी (हाइड्रोफिलिक) अणु है, इसलिए यह कोशिका झिल्ली से होकर नहीं गुजर सकता है। क्यों? जीवाणु को प्लाज्मिड लेने के लिए बाध्य करने से पूर्व यह आवश्यक है कि जीवाणु कोशिका को डीएनए लेते हेतु ‘सक्षम’ बनाया जाए। ऐसा करने के लिए पहले द्विसंयोजन धनायन (डाइबैलेंट कैटायन) जैसे कि कैल्सियम की विशिष्ट सांद्रता के साथ संसाधित किया जाता है। इससे डीएनए को जीवाणु की कोशिका भित्ति में स्थित छिद्रों से प्रवेश करने में काफी सहायता मिलती है। ऐसी कोशिकाओं को पुनर्योगज डीएनए के साथ पहले बर्फ पर रखा जाता है तब पुनर्योगज डीएनए को उन कोशिकाओं में बलपूर्वक प्रवेश कराया जाता है। इसके बाद उन्हें थोड़े समय के लिए 42 डिग्री. सेल्सीयस (तापप्रघात) पर रखा जाता है और पुनः इसे वापस बर्फ पर रखा जाता है। ऐसा करने से पुर्रयोगज डीएनए जीवाणु में प्रवेश कर जाता है।
परपोषी कोशिकाओं में विजातीय डीएनए को प्रवेश कराने हेतु केवल यही विधि नहीं है। सूक्ष्म अंतःक्षेपण (माइक्रोइंजेक्सन) विधि में पुनर्योगज डीएनए को सीधे जंतु कोशिका के केंद्रक के भीतर अंतःक्षेपित किया जाता है। दूसरी विधि जो पौधों के लिए उपयोगी है, कोशिकाओं पर डीएनए से विलेपित, स्वर्ण या टंगस्टन के उच्च वेग सूक्ष्म कणों से बमबारी करते हैं जिसे बायोलिस्टीक या जीन गन कहते हैं। अंतिम विधि जिसमें “ अहानिकारक रोगजनक’ संवाहक का उपयोग किया जाता है। इन सवांहकों को जब कोशिकाओं को संक्रमित करने दिया जाता है तब ये पुनर्योगज डीएनए को परपोषी में स्थानांतरित कर देते हैं।
आप पुनर्योगज डीएनए निर्माण के तरीकों के बारे में सीख चुके होंगे। अब उन प्रक्रमों का वर्णन करेंगे जो पुनर्योगज डीएनए प्रौद्योगिकी को आगे बढ़ाने में सुगम बनाते हैं।
9.3 पुनर्योगज डीएनए प्रौद्योगिकी के प्रक्रम
पुनर्योगज डीएनए प्रौद्योगिकी (टेक्नोलॉजी) चरण विशिष्ट अनुक्रम में सम्मिलित हैं जैसे डीएनए का विलगन (पृथक्करण), डीएनए का खंडन, डीएनए खंड का संवाहक से बंधन, पुनर्योगज डीएनए का परपोषी में स्थानांतरण, परपोषी कोशिकाओं का माध्यम में व्यापक स्तर पर संवर्धन व वंछित उत्पाद का निष्कर्षण। अब इन सभी चरणों की थोड़ा विस्तृत रूप में अध्ययन करेंगे।
9.3.1 आनुवंशिक पदार्थ ( डीएनए) का पृथक्करण
याद रखें कि बिना अपवाद के सभी जीव का आनुवंशिक पदार्थ न्यूक्लिक अम्ल है। अधिकांश जीवों में यह डिऑक्सीराबोन्यूक्लिक अम्ल या डीएनए है। डीएनए को प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा काटने के लिए यह आवश्यक है कि यह दूसरे वृहद्-अणुओं से मुक्त, शुद्ध रूप में होना चाहिए। डीएनए झिल्लियों से घिरा रहता है इसलिए कोशिका को तोड़कर खोलना पड़ेगा ताकि डीएनए दूसरे वृहद अणुओं जैसे आरएनए, प्रोटीन, बहुशर्करा, लिपिड के साथ मोचित (रिलीज) हो सके। यह तभी संभव है जब जीवाणु कोशिका/पादप या जंतु ऊतक, लाइसोजाइम (जीवाणु), सेलुलेज (पादपकोशिका), काइटिनेज (कवक) जैसे एंजाइम द्वारा संसाधित किए जाते हैं। आप जानते हो जीन डीएनए के लंबे अणुओं पर स्थित होते हैं व हिस्टोन जैसे प्रोटीनों के साथ गुँथे रहते हैं। आरएनए को राइबोन्यूक्लियेज से उपचारित कर अलग कर सकते हैं जबकि प्रोटीन को प्रोटीएज से उपचारित कराने के बाद अलग कर सकते हैं। दूसरे अणुओं को उचित उपचार द्वारा अलग कर सकते हैं। अंततोगत्वा द्रुतशीतित (चिल्ड) एथेनॉल मिलाने से शोधित डीएनए अवक्षेपित (प्रेसिपिटेट) हो जाता है। इसे निलंबन में महीन धागों के समूह के रूप में देख सकते हैं (चित्र 9.5)।
चित्र 9.5 पृथक किए गए डीएनए को स्पूलिंग द्वारा अलग करना
9.3.2 डीएनए को विशिष्ट स्थलों पर काटना
शोधित डीएनए अणुओं को प्रतिबंधन एंजाइम के साथ उनकी इष्टतम (ऑप्टिमम) परिस्थितियों में रखने पर प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा पाचन संपन्न होता है। ऐगारोज जेल वैद्युत का संचलन प्रतिबंधन एंजाइम पाचन को नियंत्रित करने के काम में आता है। डीएनए एक ऋणात्मक आवेशित अणु है। इस कारण से यह धनात्मक इलेक्ट्रोड (एनोड) की ओर गति करता है (चित्र 9.3)। यह प्रक्रम संवाहक डीएनए के साथ भी दोहराया जाता है।
डीएनए के जुड़ने में कई प्रक्रम शामिल हैं। स्रोत डीएनए व संवाहक डीएनए को भी विशिष्ट प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा काटे जाने के बाद, स्रेत डीएनए से कटा हुआ ‘उपयोगी जीन’ तथा उसकी खाली जगह के साथ संवाहक आपस में लाइगेज द्वारा जोड़ दिए जाते हैं। परिणामस्वरूप एक पुनर्योगज डीएनए का निर्माण होता है।
9.3.3 पीसीआर का उपयोग करते हुए लाभकारी जीन का प्रवर्धन
पीसीआर का अर्थ पोलीमरेजचेन रिऐक्शन ( पॉलिमरेज श्रृंखला अभिक्रिया) है। इस अभिक्रिया में उपक्रमकों (प्राइमर्स- छोटे रासायनिक संश्लेषित अल्पन्यूक्लियोटाइड जो डीएनए क्षेत्र के पूरक होते हैं) के दो समुच्चयों (सेट्स) व डीएनए पॉलिमरेज एंजाइम का उपयोग करते हुए पात्रे (इनविट्रो) विधि द्वारा उपयोगी जीन के कई प्रतिकृतियों का संश्लेषण होता है। यह एंजाइम जिनोमिक डीएनए को टेंपलेट के रूप में काम में लेकर; अभिक्रिया से मिलने वाले न्यूक्लियोटाइडों का उपयोग करते हुए उपक्रामकों को विस्तृत कर देता है। यदि डीएनए प्रतिकृतयेन प्रक्रम कई बार दोहराया जाता है तब डीएनए खंड को लगभग एक अरब गुना (एक बिलियन) प्रवर्धित किया जा सकता है अर्थात् एक अरब प्रतिरूपों का निर्माण होता है। यह सतत् प्रवर्धन तापस्थायी (थर्मोस्टेबल) डीएनए पॉलिमरेज (जीवाणु, थर्मस एक्वेटिकस से पृथक किया गया है) द्वारा किया जाता है। उच्च तापमान द्वारा प्रेरित द्विलड़ीय डीएनए के विकृतीकरण के समय भी यह हमेशा सक्रिय बना रहता है। यदि आवश्यकता पड़े, तो अब प्रवर्धित खंड को संवाहक के साथ बांध कर आगे क्लोनिंग में प्रयोग कर सकते हैं। (चित्र 9.6)
चित्र 9.6 पालिमरेज शृंखला अभिक्रिया (पीसीआर) का प्रदर्शन — प्रत्येक चक्र में तीन चरण हैं — (अ) निष्क्रियकरण (ब) उपक्रामक तापानुशीलन व (स) उपक्रामकों का विस्तार
9.3.4 पुनर्योगज डीएनए का परपोषी कोशिका/जीव में निवेशन
बँधे हुए डीएनए को आदाता कोशिका में प्रवेश कराने की अनेक विधियाँ हैं। यह कार्य जब आदाता कोशिका अपने चारों तरफ स्थित डीएनए को धारण करने में सक्षम हो जाए तब किया जा सकता है। यदि पुनर्योगज डीएनए को जिसमें प्रतिजैविक (उदाहरण-एंपिसिलिन) के प्रति प्रतिरोधी जीन स्थित होता है, ई कोलाई कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाए तो परपोषी कोशिकाएँ प्रतिरोधी कोशिकाओं में रूपांतरित हो जाती है। यदि रूपांतरित कोशिकाओं को युक्त ऐगार प्लेट पर फैलाया जाता है तो केवल कोशिकाएँ ही विकसित हो पाती हैं जबकि अरूपांतरित आदाता कोशिकाओं की मृत्यु हो जाती है। प्रतिरोधी जीन के कारण कोई भी एंपिसिलिन की उपस्थिति में रूपांतरित कोशिका का चयन कर सकता है। इस मामलें में प्रतिरोधी जीन को वरणयोग्य चिह्नक कहते हैं।
9.3.5 बाहरी जीन उत्पाद को प्राप्त करना
जब आप विजातीय डीएनए खंड का क्लोनिंग संवाहक में निवेश कराकर किसी भी जीवाणु, पौधा या जंतु कोशिका में स्थानांतरित करते हैं तो विजातीय डीएनए इनमें गुणित होने लगता है। लगभग सभी पुनर्योगज प्रौद्योगिकियों का अंतिम उद्देश्य वांछित प्रोटीन का उत्पादन करना ही होता है। इसके लिए पुनर्योगज डीएनए के अभिव्यक्त होने की आवश्यकता होती है। बाहरी जीन उपयुक्त परिस्थितियों में अभिव्यक्त होते हैं। बाहरी जीन की परपोषी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति को समझने के लिए कई तकनीकी बातों को विस्तारपूर्वक जानना जरूरी है।
वांछित जीन को क्लोन करने, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने वाली परिस्थितियों को अनुकूलतम बनाने के बाद कोई भी इनका व्यापक स्तर पर उत्पादन करने के बारे में सोच सकता है। क्या आप कोई कारण बता सकते हैं कि बड़े पैमाने पर उत्पादन क्यों आवश्यक है? यदि कोई प्रोटीन कूटलेखन (इनकोडिंग) जीन किसी विषमजात (हेटेरोलोगस) परपोषी में अभिव्यक्त होता है तो इसे ‘पुनर्योगज प्रोटीन’ कहते है। लाभकारी क्लोनित जीनों को आश्रय देने वाली कोशिकाओं का छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला में वर्धन किया जा सकता है। संवर्धन को वांछित प्रोटीन के निष्कर्षण में प्रयोग कर सकते हैं व पृथक्करण की विभिन्न तकनीकों का प्रयोग करते हुए इस प्रोटीन का शोधन करते हैं।
कोशिकाओं को सतत् संवर्धन तंत्र में गुणित कर सकते हैं, जिसमें उपयोग किए गए माध्यम को एक तरफ से निकालकर दूसरी तरफ से ताजा माध्यम को भरते हैं ताकि कोशिकाएँ अपने क्रियात्मक रूप से सर्वाधिक सक्रिय लॉग (एक्स्पोनोन्शियल) प्रावस्था में बनी रहें। यह संर्वधन विधि अधिक जैवमात्रा के उत्पादन से वांछित प्रोटीन के अधिक उत्पादन हेतु उपयोगी है।
कम आयतन संवर्धन से उत्पाद की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन नहीं हो सकता। इन उत्पादों के अधिक मात्रा में उत्पादन हेतु बायोरिटर के विकास की आवश्यकता थी, जहाँ सवर्धन का अधिक आयतन (100-1000 लीटर) संशोधित किया जा सके। इस प्रकार बायोरिएक्टर एक बर्तन के समान है, जिसमें सूक्ष्मजीवों, पौधों, जंतुओं व मानव कोशिकाओं का उपयोग करते हुए कच्चे माल को जैव रूप से विशिष्ट उत्पादों व्यष्टि एंजाइम आदि, में परिवर्तित किया जाता है। बायोरिएक्टर, वांछित उत्पाद पाने के लिए, अनुकूलतम परिस्थितियाँ उपलब्ध करता है। वृद्धि के लिए ये अनुकूलतम परिस्थितियाँ हैतापमान, पीएच, क्रियाधार, लवण, विटामिन, ऑक्सीजन।
जो बायोरिएक्टर सामान्यतया सर्वाधिक उपयोग में लाया जाता है वह विलोडन (स्टिरिंग) प्रकार का है जिसे चित्र 9.7 में दर्शाया गया है।
चित्र 9.7 (अ) साधारण बिलोडन हौज बायोरिएक्टर (ब) दंड विलोडक हौज बायोरिएक्टर जिसके द्वारा जीवाणु विहीन हवा के बुलबुलों का प्रवेश
विलोडित हौज रिएक्टर सामान्यतया बेलनाकार होते हैं या जिनके आधार घुमावदार होने से रिएक्टर के अंदर अंर्तवस्तु के मिश्रण में सहायता मिलती है। विलोडक बायोरिएक्टर में ऑक्सीजन उपलब्धता व उसके मिश्रण का काम करते हैं। विकल्पतः हवा बुलबले के रूप में बायोरिएक्टर में भेजी जा सकती है। यदि आप चित्र को ध्यान से देखें तो पायेंगे कि रिएक्टर में एक प्रक्षोभक तंत्र (एजिटेटर सिस्टम), ऑक्सीजन प्रदाय तंत्र, झाग नियंत्रण तंत्र, तापक्रम नियंत्रण तंत्र, पीएच नियंत्रण तंत्र व प्रतिचयन प्रद्वार लगा होता है जिससे संवर्धन की थोड़ी मात्रा समय-समय पर निकाली जा सकती है।
9.3.6 अनुप्रवाह संसाधन
जैव संश्लेषित अवस्था के पूर्ण होने के बाद परिष्कृत तैयार होने व विपणन के लिए भेजे जाने से पहले कई प्रक्रमों से होकर गुजरता है। इन प्रक्रमों में पृथक्करण व शोधन सम्मिलित है और इसे सामूहिक रूप से अनुप्रवाह संसाधन कहते हैं। उत्पाद को उचित परिरक्षक के साथ संरूपित करते हैं। औषधि के मामले में ऐसे संरूपण (फार्मुलेशन) को चिकित्सीय परीक्षण से गुजारते हैं। प्रत्येक उत्पाद के लिए सुनिश्चित गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण की भी आवश्यकता होती है। अनुप्रवाह संसाधन व गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण प्रत्येक उत्पाद के लिए भिन्न-भिन्न होता है।
सारांश
जैव प्रौद्योगिकी जीवधारियों, कोशिकाओं व एंजाइमों का प्रयोग करते हुए उत्पादों व प्रक्रमों का व्यापक स्तर पर उत्पादन व विपणन करने से संबंधित है। आधुनिक जैव प्रौद्योगिकी में आनुवंशिकतः रूपांतरित जीवों का उपयोग तभी संभव हो पाया जब मनुष्य ने डीएनए के रसायन को परिवर्तित व पुनर्योगज डीएनए का निर्माण करना सीख लिया। इस प्रमुख प्रक्रम को पुनर्योगज डीएनए प्रौद्योगिकी या आनुवंशिक इंजीनियरिंग कहते हैं। इस प्रक्रम में प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज, डीएनए लाइगेज, समुचित प्लाज़्मिड या विषाणु संवाहक को डीएनए के पृथक करने व परपोषी जीवों में विजातीय डीएनए का स्थानांतरण, बाहरी जीन की अभिव्यक्ति, जीन उत्पाद अर्थात् सक्रिय प्रोटीन का शोधन और अंत में विपणन के लिए उपयुक्त संरूपण बनाना शामिल है। व्यापक स्तर पर उत्पादन में बायोरिएक्टर का उपयोग होता है।
अभ्यास
1. क्या आप दस पुनर्योगज प्रोटीन के बारे में बता सकते हैं जो चिकित्सीय व्यवहार के काम में लाए जाते हैं? पता लगाइये कि वे चिकित्सीय औषधि के रूप में कहाँ प्रयोग किए जाते हैं। (इंटरनेट की सहायता लें)।
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2. एक सचित्र (चार्ट) (आरेखित निरूपण के साथ) बनाइए जो प्रतिबंधन एंजाइम को, (जिस क्रियाधार डीएनए पर यह कार्य करता है उसे), उन स्थलों को जहाँ यह डीएनए को काटता है व इनसे उत्पन्न उत्पाद को दर्शाता है।
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3. कक्षा ग्यारहवीं में जो आप पढ़ चुके हैं उसके आधार पर क्या आप बता सकते हैं कि आणविक आकार के आधार पर एंजाइम बड़े हैं या डीएनए। आप इसके बारे में कैसे पता लगायेंगे?
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4. मानव की एक कोशिका में डीएनए की मोलर सांद्रता क्या होगी? अपने अध्यापक से परामर्श लीजिए।
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5. क्या सुकेंद्रकी कोशिकाओं में प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज मिलते हैं? अपने उत्तर सही सिद्ध कीजिए।
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6. अच्छी हवा व मिश्रण विशेषता के अतिरिक्त की तुलना में कौन सी अन्य कंपन्न फ्लास्क सुविधाएँ हैं?
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7. शिक्षक से परामर्श कर पाँच पैलिंड्रोमिक अनुप्रयास करना होगा कि क्षारक-युग्म नियमों का पालन करते हुए पैलिंड्रोमिक अनुक्रम बनाने के उदाहरण का पता लगाइए।
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8. अर्धसूत्री विभाजन को ध्यान में रखते हुए क्या बता सकते हैं कि पुनर्योगज डीएनए किस अवस्था में बनते हैं?
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9. क्या आप बता सकते हैं कि प्रतिवेदक (रिपोर्टर) एंजाइम को वरणयोग्य चिह्न की उपस्थिति में बाहरी डीएनए को परपोषी कोशिकाओं में स्थानांतरण के लिए मॉनिटर करने के लिए किस प्रकार उपयोग में लाया जा सकता है?
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10. निम्नलिखितों का संक्षिप्त वर्णन कीजिए-
(क) प्रतिकृतीयन का उद्भव
(ख) बायोरिएक्टर
(ग) अनुप्रवाह संसाधन
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11. संक्षेप में बताइए
(क) पीसीआर
(ख) प्रतिबंधन एंजाइम और डीएनए
(ग) काइटिनेज
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12. अपने अध्यापक से चर्चा करके पता लगाइए कि निम्नलिखित के बीच कैसे भेद करेंगे-
(क) प्लाज्मिड डीएनए और गुणसूत्रीय डीएनए
(ख) आरएनए और डीएनए
(ग) एक्सोन्यूक्लिएज और एंडोन्यूक्लिएज
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